>‘Oˆ— section « 4“PFA/PBS Fix at RT@15' « wash in PBS 5'x2 « ProK in 10mM Tris-Cl(pH8.0) 37Ž 10' (1M Tris 1.5mL + 500mM EDTA 0.3mL + 15mg/mL ProK 75ul) « 4% PFA/PBS Fix at RT@10' « wash in PBS@5'x2 « 0.1M Triethanolamine/HCl 1' (5.3mL Triethanolamine + 0.9mL HCl in 400mL H2O) « +1mL acetic anhydride, gently stir, 10' at RT « wash in PBS « air dry *hybridization B(20x): @100% formamide 2mL @1M Tris-Cl(7.6) 40ul @10mg/mL tRNA 80ul @50% dextran 0.8mL @50x denhalt's 80ul @5M NaCl 480ul @10% SDS 100ul @0.5M EDTA 8ul @dH2O 412ul 1ul flu probe + 1ul DIG probe in 200ul Buf >Hybridization 51Ž, 16h in moisture chamber >wash 5xSSC at 55Ž in a beaker « 50% formamide / 2xSSC, 65Ž@15' « 2xSSC 65Ž@15' « 0.2xSSC 65Ž@15' x2 « PBS « blocking B (1% blocking reagent/PBS) 60' « anti-DIG-HRP (Roche) (1/50) « bio-TSA (1/100) + 1/100 0.15% H2O2 in PBS/0.01M Imidazole 20' « HRPŽ¸Šˆ 3% H2O2 in PBS >2h « Rb anti-flu-HRP (PerkinElmer) (1/100) +StAv488 60' « Cy3-TSA (1/100) + 1/100 0.15% H2O2 in PBS/0.01M Imidazole 15' « wash